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MicroCT检查测量试验扫描,佩斯病的团伙形态学观

发布时间:2019-09-12 09:07编辑:化学科学浏览(136)

    中国化工仪器网 产品新闻Micro-CT(micro computed tomography,微计算机断层扫描技术),又称为显微CT、微焦点CT或者微型CT,是一种非破坏性的3D成像技术,可以在不破坏样本的情况下清楚了解样本的内部显微结构。1980年代,由于普通CT无法满足科学研究对分辨率的苛刻要求,学术界开始研发显微CT。MicroCT采用了与普通临床CT不同的微焦点X线球管,分辨率高达几个微米,仅次于同步加速X线成像设备的水平,具有良好的“显微”作用。 一、服务优势: 特点:仪器具有快速扫描、简易控制、小巧玲珑和使用免保养等特点,实现了在一个理想的分辨率条件下对物体进行非破坏性的三维显微成像观察。 精度/层厚5-100μm。可调节范围广,操作性好。 二、成像原理: MicroCT采用了与普通临床CT不同的微焦点X线球管,分辨率高达几个微米,仅次于同步加速X线成像设备的水平,具有良好的“显微”作用。锥形X线束(Cone Beam)不仅能够获得真正各向同性的容积图像,提高空间分辨率,提高射线利用率,而且在采集相同3D图像时速度远远快于扇形束CT。 三、参数设置: 例如,扫描大鼠股骨离体样品,如下: 扫描协议:44mltube15um155minss 扫描参数:扫描精度/层厚15um,电压80kv,电流114uA,旋转角度0度,曝光时间500ms,选用的滤片为0.5mm铝板,像素组合为1056*1056。 四、三维重构、数据分析: 检测扫描完成之后,得到2D图像,运用Mimics软件进行三维重构处理,得到3D图。重建完成后,利用ABA专用骨骼分析软件分析检测以下参数: 体积骨密度(Volumetric BMD,vBMD):为骨组织的表观密度,反映所选区域内的总体骨矿盐密度,骨矿化水平。 骨体积分数(bone volume fration,BV/TV):用体视学算法得到ROI区域内骨组织体积除以所有体素总体积,是标化后的骨体积。 骨面积分数(bone surface fraction .BS/BV):用提醒学算法得到ROI区域内骨组织总面积除以该区域内骨组织总体积,描述骨组织表面面积的变化。 骨小梁厚度(trabecular thichness,Tb.Th):用体现学算法计算得到单位体积内骨小梁的厚度,描述骨小梁厚度的变化。 骨小梁间隔(trabecular separation,Tb.Sp):用体现学算法计算得到单位体积内骨小梁之间的间隔,体现多孔骨组织骨小梁间距离。 骨小梁数量(trabecular number,Tb.N):用体现学算法计算得到单位体积内骨小梁数量,来反映骨小梁数量变化。 结构模型指数(stucture model index ,SMI):用于评价骨小梁的结构形态,,理想的板状骨小梁和杆状骨小梁的SMI数值分别为0和3。发生骨质疏松时,骨小梁从板状向杆状转变,SMI数值增加。SMI越大,说明骨小梁结构越接近球形;若SMI为负值,表明所观察的组织为致密组织。SMI是板状结构向杆状结构转变是松质骨退变的重要特征。 骨小梁连接密度(Connectivity Density,Conn.D.):为标化体积后的Euler指数,是反映骨小梁连接性能的重要指标。但是可因大量骨小梁板状结构的穿孔而造成假性增高。 各向异性度(degree of anisotropy,DA):为评价骨小梁结构方向性的指标,反映骨小梁顺应力分布的优势方向。 附:数据图示BV/TV,Tb.N,Tb.Th,BMD,,,,,,,,图片 1

    累-卡-佩斯病是由于犬股骨头的部分骨骺失去血液供应,导致受侵袭区缺血变性坏死、股骨头塌陷,进而造成髋关节不同程度的畸形,并引发变性骨关节病的一种髋关节疾病。

    累-卡-佩斯病是由于犬股骨头的部分骨骺失去血液供应,导致受侵袭区缺血变性坏死、股骨头塌陷,进而造成髋关节不同程度的畸形,并引发变性骨关节病的一种髋关节疾病。随着饲养宠物犬的种类和数量急剧的增加,临床LCPD的病例也显著增多。该病常发生于迷你贵宾、约克夏、比熊等小型品种犬。目前国外有部分对于犬累-卡-佩斯疾病概述及基因方面的研究报道,而国内仅有少量对于该病的手术治疗报道。尚未有针对临床病例进行组织病理学研究的相关报道。本试验直接采用临床病例的股骨头样本,观察组织形态及病理变化,是国内首次采用Micro-CT对犬累-卡-佩斯病的样本进行扫描并进行描述。

    1 材料与方法

    1.1 样本的获取

    收集中国农业大学动物医院进行股骨头切除的迷你贵宾犬的股骨头样本20例,其中LCPD样本15例,正常样本5例。动物年龄最小的6个月,最大的13个月,平均年龄为8个月。患犬临床症状均表现为:患侧肢间歇性或持续性跛行、减负体重、髋关节疼痛、患肢肌肉出现不同程度的萎缩。所有样本均由手术取出后,无菌纱布块包裹,-20℃低温保存备用。

    1.2 试验方法

    1.2.1 大体观察

    对手术切除的股骨头进行大体形态及表面结构的观察。

    1.2.2 Micro-CT扫描

    分别在正常样本和LCPD样本中随机抽取2个样本进行显微计算机断层扫描(Micro-computed tomography,Micro-CT;Sky-scan公司Micro-CT 1172,比利时)。Micro-CT 的检测无需对样本进行处理。将样本放在塑料固定器内,置于Micro-CT系统的检测样本台上,在设置扫描数据后对样本进行扫描,获得连续的Micro-CT断层图像,像素点尺寸3.7×3.7μm,图像分辨率为4000×4000,层间距3.7μm,图像灰度级16bit。

    1.2.3 光镜观察

    将样本沿股骨头冠状面锯开,取一半样本放入10%福尔马林溶液中,室温下放置48h。将固定后的样本冲洗后放入5%硝酸进行脱钙至骨组织变软。取股骨头负重区组织进行修块、冲洗、常规组织切片。行H.E.染色以及5%甲苯胺蓝染色,镜下观察股骨头组织结构特点。甲苯胺蓝染色观察组织中粘多糖的分布情况。

    1.2.4 扫描电镜观察

    分别取股骨头负重区组织0.5cm×0.5cm×0.2cm组织块,2.5%戊二醛固定,PBS洗涤,1%锇酸固定后PBS洗涤,乙醇逐级脱水,醋酸异戊酯置换,临界点干燥(HITACHIHCP-2),离子溅射(EIKO IB-3)喷金,电镜(HITACHI S-3400N)扫描观察其组织结构特点。

    2 试验结果

    2.1 大体观察

    正常犬股骨头呈半球形,关节面光滑完整,股骨颈为圆柱体并从股骨头端至股骨端逐渐均匀增粗。LCPD犬的股骨头变扁平,关节面粗糙有裂痕,股骨颈增粗,病情严重的股骨头关节面出现部分塌陷、碎裂,甚至完全失去股骨头正常的球形结构。

    2.2 Micro-CT 扫描观察

    获得正常犬和LCPD犬的股骨头骨小梁结构的三维图形。在正常犬上可以观察到骨骺和干骺端松质骨的骨小梁均匀规则分布,而在LCPD犬可以观察到骨小梁出现塌陷,形成空洞、不连续,部分骨小梁增厚,股骨头骨骺受累。

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    2.3 光镜观察

    2.3.1 H.E.染色

    正常股骨头骨组织样本软骨层软骨细胞分布均匀,软骨细胞无坏死,软骨陷窝无空虚;骨小梁排列整齐,偶有少量的空骨陷窝;骨髓内脂肪细胞大小均匀,增大及增多现象不显著。LCPD样本中毛细血管及纤维组织侵入坏死区髓腔内,肉芽组织生长旺盛,骨小梁出现坏死。病程较长的病例,出现大量死亡的骨细胞即空骨陷窝。部分骨小梁被大量的肉芽组织代替,脂肪小囊进一步增大或者破裂,髓腔、骨小梁内充满了新生的结缔组织。

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    2.3.2 甲苯胺蓝染色

    相比正常的股骨头病变的股骨头软骨面粗糙,表层有裂隙,软骨细胞簇集。软骨基质薄,甲苯胺蓝染色表层有失染现象,软骨基质着色不均,潮线破坏。

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    2.4 扫描电镜观察

    观察到正常组股骨头骨小梁结构规整致密,互相连接性好,骨髓腔规则,骨小梁数目较多。150倍镜下可见骨小梁走向清晰,排列紧密。LCPD的骨小梁发生明显变化,失去正常的拱桥状结构,骨髓腔扩大,骨小梁连续性严重破坏,出现穿孔、断裂、表面不光整,有骨面破坏。

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    3 讨论

    累-卡-佩斯病是常发于3-13月龄的玩具犬和迷你犬种的一种发育异常的疾病。该病高发于6-7月龄,体重小于10kg的个体;无明显的性别差异;通常为单侧后肢发病,12%-16%的患犬为双侧发病。尽管在犬有一些调查研究该病的可能发病原因,包括:遗传因素、感染因素、损伤、代谢影响、激素紊乱以及血管畸形等,但确切病因仍未知。由于该病是自然发病且病因不明,故难以预测和预防。有研究已经确定了LCPD在一些犬种的遗传模式,包括曼切斯特犭更犬、约克夏、迷你贵宾、八哥犬。在这些犬上LCPD的遗传模式是受多因素影响的常染色体的单基因隐性遗传。

    该病包含骨坏死、骨吸收、新骨形成以及股骨头重新塑形等系列病理变化,表现在同一病灶中既有骨坏死又有骨修复。其病理改变不同于其他骨坏死疾病,并且动物试验研究迄今未能做出类似的动物模型。其病理过程分为以下几个时期:缺血性坏死期、血运再生期、骨折期、潜行替代期、重新骨化期以及愈合期。组织缺血使血运停止,骨细胞细胞核缺失或回缩,可见到空骨陷窝。同时软骨内骨化停止。血运再生使软骨内骨化重新开始。其过程由周边向中心过渡,成骨细胞和破骨细胞覆盖在缺血性坏死骨表面,新生骨在坏死骨表面沉积导致骨密度增加。在软骨下区骨吸收快于骨再生,股骨头丧失其稳定结构。过重负荷可导致骨小梁骨折。坏死骨逐渐缓慢、不规则地吸收,并为纤维组织替代,纤维组织的骨化是不规则。潜行替代期和再骨化期对于股骨头的包容极为重要,被称为“生物塑形期”。

    本试验观察到临床患犬典型的组织病理变化与发病的病程长短有密切关系。病程越长股骨头变化越明显。镜下表现出骨髓腔内脂肪细胞增多,体积增大,骨小梁断裂、塌陷、骨面破坏,失去正常结构,伴有肉芽组织生长。甲苯胺蓝着色严重减少,证明股骨头软骨基质成分蛋白多糖的丢失,同时观察到软骨表面出现裂隙和缺损,软骨细胞簇集、潮线破坏表明髋关节已经出现关节炎征象。Micro-CT图像可以明显观察到股骨头部分碎裂和骨小梁的破坏。部分骨小梁出现增厚表明坏死骨组织已经逐渐被吸收并为纤维组织替代,新生骨形成。股骨头重新塑形。表明该病已经处于疾病的后期。

    Micro-CT对样本的处理简单,可直接扫描取材后的新鲜样本或冰冻样本,比切片复杂的切取、制备、染色过程方便得多,因Micro-CT对样本的检测是无损性的,同一样本扫描后还能用别的方法如:病理切片染色处理,生物力学试验,电镜扫描等处理,以进行对比分析。可得到不依赖于二维模型的三维微结构,并且能够对变化中的骨结构如骨小梁的体积、骨小梁间隙、骨小梁厚度、骨小梁数目等进行定量分析。本试验使用Micro-CT对犬的股骨头进行了初步的三维微结构的观察。相信利用Micro-CT技术对LCPD的微观结构进行定量分析,将对研究疾病病理、指导治疗、判断预后以及药物药效的观察方面发挥重大作用。

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